啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚粕渣飼料制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2020-08-07 16:28:42 點(diǎn)擊：

摘要：通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚粕渣飼料制備工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明:基料制備最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間5d、棕櫚仁渣目數(shù)70目、菌料比1∶103、發(fā)酵溫度30℃、含水量36%，該條件下基料中總菌落數(shù)為7.20×1010個(gè)/g;發(fā)酵產(chǎn)物最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、棕櫚果渣與空果串配比1∶2、棕櫚果渣及空果粉碎長(zhǎng)度4cm、配料比1∶10(基料與棕櫚果渣和空果串質(zhì)量比)、含水量35%、發(fā)酵時(shí)間36d，該條件下發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值為0.966。對(duì)發(fā)酵飼料主要成分進(jìn)行分析，其粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，總菌落數(shù)為9.0×107個(gè)/g。該發(fā)酵方法工藝簡(jiǎn)單，具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。

油棕櫚(Trachycarpus fortunei(Hook，f.)H.Wendl.)原產(chǎn)于非洲西部海岸，后傳入馬來(lái)西亞和印度尼西亞等東南亞各國(guó)并被廣泛種植。棕櫚粕渣是油棕櫚果實(shí)提油后的副產(chǎn)品，根據(jù)提油工藝時(shí)序，棕櫚粕渣由空果串、果渣、仁渣3部分組成。棕櫚粕渣價(jià)格低廉、資源豐富、無(wú)毒副作用，從能量和蛋白等營(yíng)養(yǎng)成分看，是一種開發(fā)潛力巨大的飼料資源。目前，棕櫚粕渣中的仁渣通過(guò)部分替代或添加的形式被廣泛應(yīng)用于家禽飼料和反芻動(dòng)物飼料，并且在雞、鴨、魚、鵝、豬、牛、羊等動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的經(jīng)濟(jì)效益。棕櫚仁渣以其粗蛋白、粗脂肪、能量高的特點(diǎn)在畜禽飼料中日漸廣泛應(yīng)用，而棕櫚空果串和果渣則成了廢料，除了少部分用于肥料使用，大多數(shù)以廢棄物的形式被丟棄，資源浪費(fèi)嚴(yán)重，油棕櫚資源未能得到充分的綜合利用，同時(shí)也存在棕櫚仁渣過(guò)量添加導(dǎo)致的日糧纖維較高和飼料消化率降低等問題。

隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，固態(tài)發(fā)酵飼料作為一種綠色環(huán)保的新型飼料，越來(lái)越受到動(dòng)物養(yǎng)殖戶的青睞。固態(tài)發(fā)酵飼料主要通過(guò)人為控制有益微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，在提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等)水平、增加飼料中益生菌數(shù)量的同時(shí)減少飼料抗生素應(yīng)用，降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，使畜禽更容易采食、消化和吸收且無(wú)毒害作用，是未來(lái)飼料的發(fā)展趨勢(shì)。固態(tài)發(fā)酵飼料提高飼料價(jià)值主要采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、戊糖片球菌、酵母菌、黑曲霉和米曲霉等。酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠分泌大量水解酶類，利用發(fā)酵底物中的無(wú)機(jī)氮源和碳水化合物合成微生物蛋白，有效降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)。乳酸菌發(fā)酵飼料不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及利用率高，而且乳酸含量極其豐富，擁有獨(dú)特的氣味，誘食效果良好，能夠增加動(dòng)物進(jìn)食量。經(jīng)過(guò)微生物復(fù)合菌發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵飼料能增加反芻動(dòng)物瘤胃纖維分解菌(黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)和乳酸產(chǎn)生菌(嗜酸乳酸桿菌和牛鏈球菌)數(shù)量，進(jìn)而提高飼料消化率。

本研究采用啤酒酵母和乳酸菌對(duì)棕櫚仁渣進(jìn)行厭氧發(fā)酵(基料制備)，以啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵制備的發(fā)酵基料和棕櫚果渣、棕櫚空果串為原料進(jìn)行二次厭氧發(fā)酵，在確定單因素的基礎(chǔ)上利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法分別對(duì)影響基料中總菌落數(shù)和發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值的主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定數(shù)學(xué)模型及最佳工藝條件，旨在為棕櫚粕渣資源高值化利用及發(fā)酵飼料工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

棕櫚粕渣為馬來(lái)西亞國(guó)立大學(xué)提供，由Sime Darby公司提油后的油棕櫚果仁渣、果渣及空果串組成，其主要成分見表1。

飼料發(fā)酵菌種為啤酒酵母和乳酸菌，購(gòu)自上海炎地農(nóng)業(yè)科技有限公司，其中啤酒酵母有效菌種數(shù)量≥200億個(gè)/g，乳酸菌有效菌種數(shù)量≥30億個(gè)/g。

FL-30B萬(wàn)能粉碎機(jī)，METTLER PM 200電子天平，LDZH-200KBS立式高壓蒸汽滅菌器，SHP-250智能生化培養(yǎng)箱，XSM-20生物顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基料的制備

棕櫚仁渣粉碎后過(guò)篩，精確稱取20.00g，置于650mL培養(yǎng)瓶中，參考預(yù)實(shí)驗(yàn)，加入0.25%紅糖水，蓋上透氣蓋，121℃滅菌40min，冷卻至室溫后加入啤酒酵母和乳酸菌的混合菌粉，蓋上密封蓋，放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

棕櫚果渣及空果串粉碎后，精確稱取25.00g，121℃滅菌40min后在(60±2)℃條件下干燥24h，冷卻備用。精確稱取一定量的基料與備用棕櫚果渣及空果串充分混合至于真空袋中，加入無(wú)菌水，排除空氣封口，放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

1.2.3 基料和發(fā)酵產(chǎn)物中總菌落數(shù)的測(cè)定

精密稱取基料或發(fā)酵產(chǎn)物0.10g至滅菌試管中，吸取2mL無(wú)菌水稀釋，搖勻，參照ISO 4833—2003方法，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算基料和發(fā)酵產(chǎn)物中總菌落數(shù)。

總菌落數(shù)=(啤酒酵母數(shù)+乳酸菌數(shù))×稀釋體積/棕櫚粕渣發(fā)酵飼料稱取質(zhì)量

1.2.4 基料和發(fā)酵產(chǎn)物成分分析

參照GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002和GB/T 6435—2014進(jìn)行基料和發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量的測(cè)定。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分歸一化值

以發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、水分含量和總菌落數(shù)為指標(biāo)采用Hassan法進(jìn)行歸一化處理，對(duì)取值越小越好的因素(粗纖維、粗灰分)和取值越大越好的因素(粗蛋白、粗脂肪、鈣、磷、總菌落數(shù))分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求歸一值dmin和dmax，各指標(biāo)歸一值求算幾何平均數(shù)，得總評(píng)歸一值OD。公式如下:

dmin=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)

dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

OD=(d1d2d3…dk)1/k式中:d為單指標(biāo)評(píng)價(jià)值;Yi為指標(biāo)中第i個(gè)值;Ymin為指標(biāo)中最小值;Ymax為指標(biāo)中最大值;OD為總評(píng)歸一值;k為指標(biāo)數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較;采用Design-Expert 10.0.4軟件中的F檢驗(yàn)(tape III)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析;采用Origin 9.4制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 基料制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在基料制備過(guò)程中，為使啤酒酵母和乳酸菌始終保持最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，固定發(fā)酵時(shí)間為5d，通過(guò)Plactett-Burman實(shí)驗(yàn)選取顯著影響基料總菌落數(shù)的4個(gè)因素(仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度、含水量)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.1.1 仁渣目數(shù)的影響

在菌料比(質(zhì)量比，下同)1∶80，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，棕櫚仁渣目數(shù)分別為10、20、40、60、80目條件下，測(cè)定基料中總菌落數(shù)，分析仁渣目數(shù)對(duì)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖1。注:圖中相同字母表示總菌落數(shù)之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，下同。圖1仁渣目數(shù)對(duì)總菌落數(shù)的影響由圖1可知，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在10～60目時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著增多(P＜0.05)，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在60～80目時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)為60目時(shí)，啤酒酵母和乳酸菌與棕櫚仁渣有效接觸面積趨于最大，隨后棕櫚仁渣因自重影響發(fā)生粘黏，有效接觸面積減少，啤酒酵母和乳酸菌無(wú)法充分利用棕櫚仁渣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)發(fā)酵。故棕櫚仁渣目數(shù)選擇60目為宜。

2.1.1.2 菌料比的影響

在仁渣目數(shù)60目，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，菌料比分別為1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120條件下，測(cè)定基料中總菌落數(shù)，分析菌料比對(duì)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)菌料比在1∶80～1∶100時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著菌料比的增大呈顯著增加趨勢(shì)(P＜0.05)，繼續(xù)增大菌料比，總菌落數(shù)顯著降低(P＜0.05)，這可能是棕櫚仁渣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被啤酒酵母和乳酸菌分解利用完畢，微生物細(xì)胞停止生長(zhǎng)甚至開始死亡所造成的結(jié)果。因此，菌料比選擇1∶100為宜。

2.1.1.3 發(fā)酵溫度的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，含水量30%，發(fā)酵溫度分別為24、26、28、30、32℃條件下，測(cè)定基料中總菌落數(shù)，分析發(fā)酵溫度對(duì)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在24～30℃時(shí)，基料中總菌落數(shù)隨著發(fā)酵溫度的上升呈顯著增加趨勢(shì)(P＜0.05)，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，總菌落數(shù)略有降低(P＞0.05)，這是因?yàn)殡S著溫度的升高酶反應(yīng)速度加快，啤酒酵母和乳酸菌細(xì)胞生長(zhǎng)代謝加快，當(dāng)溫度高于30℃時(shí)酶失活速率大于微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速率，導(dǎo)致微生物細(xì)胞衰老加快。故發(fā)酵溫度選擇30℃為宜。

2.1.1.4 含水量的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，發(fā)酵溫度30℃，含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%條件下，測(cè)定基料中總菌落數(shù)，分析含水量對(duì)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)含水量由30%增至35%時(shí)，基料中的總菌落數(shù)隨著含水量的增大而顯著增加(P＜0.05)，隨著含水量的繼續(xù)增加，總菌落數(shù)呈逐漸降低趨勢(shì)(P＜0.05)，這可能是由于適宜的含水量使得棕櫚仁渣的細(xì)小顆粒之間存在一定的空隙和合適的疏松度，有利于微生物進(jìn)入，在增大微生物與棕櫚仁渣表面接觸面積的同時(shí)排出微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2，促進(jìn)微生物菌體生長(zhǎng)。故含水量選擇35%為宜。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)原理，以仁渣目數(shù)(A)、菌料比(B)、發(fā)酵溫度(C)和含水量(D)為響應(yīng)變量，基料中總菌落數(shù)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平見表2，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

利用Design Expert10.0.4軟件對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總菌落數(shù)對(duì)仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量的二次多項(xiàng)式回歸方程:總菌落數(shù)=7.35+0.22A+1.22B+0.41C+0.28D+0.011AB-0.002AC-0.12AD+0.015BC-0.18BD-0.017CD-0.13A2-3.86B2-1.29C2-0.72D2。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表4。

由表4可知，二次回歸模型F值為154.690，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.3088＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9936，說(shuō)明99.36%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實(shí)際情況擬合，較好地反映了基料中總菌落數(shù)與仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測(cè)總菌落數(shù)隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9872，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有98.72%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于總菌落數(shù)分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)表4中F值可判斷各自變量對(duì)因變量的影響依次為B＞C＞D＞A，即菌料比對(duì)總菌落數(shù)的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵溫度(P＜0.01)、含水量(P＜0.01)和仁渣目數(shù)(P＜0.01)。由回歸方程和方差分析可知，二次項(xiàng)中B2、C2、D2對(duì)總菌落數(shù)的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。

2.1.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測(cè)基料制備的最佳工藝條件為棕櫚仁渣目數(shù)75.92目、菌料比1∶103.14、發(fā)酵溫度30.81℃、含水量35.53%，此條件下總菌落數(shù)為7.58×1010個(gè)/g。

2.1.2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時(shí)為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，將基料制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為棕櫚仁渣目數(shù)70目、菌料比1∶103、發(fā)酵溫度30℃、含水量36%，該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，總菌落數(shù)達(dá)到7.2×1010個(gè)/g，RSD為4.42%，與模型預(yù)測(cè)值誤差為5.01%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)總菌落數(shù)與預(yù)測(cè)總菌落數(shù)差異不顯著(P=0.056＞0.05)。說(shuō)明該模型可以有效預(yù)測(cè)基料制備過(guò)程中的總菌落數(shù)，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用來(lái)指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對(duì)棕櫚粕渣的發(fā)酵工藝。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在產(chǎn)物發(fā)酵過(guò)程中，為使發(fā)酵產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)成分歸一值達(dá)到最好，固定發(fā)酵溫度為30℃，棕櫚果渣與空果串配比為1∶2。通過(guò)Plactett-Burman實(shí)驗(yàn)選取顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值的4個(gè)因素(棕櫚果渣及空果串的粉碎長(zhǎng)度(以下簡(jiǎn)稱粉碎長(zhǎng)度)、基料與棕櫚果渣和空果串配料比(以下簡(jiǎn)稱配料比)、含水量、發(fā)酵時(shí)間)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.1.1 粉碎長(zhǎng)度的影響

在配料比1∶8(質(zhì)量比，下同)，含水量30%，發(fā)酵時(shí)間30d，粉碎長(zhǎng)度分別為1、3、5、7、9cm條件下，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析粉碎長(zhǎng)度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)粉碎長(zhǎng)度在1～5cm時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值隨粉碎長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而呈顯著增加趨勢(shì)(P＜0.05)，繼續(xù)增長(zhǎng)粉碎長(zhǎng)度，營(yíng)養(yǎng)成分OD值開始顯著降低(P＜0.05)，這說(shuō)明棕櫚果渣和空果串粉碎長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，會(huì)致使其與基料混合不均勻，從而影響啤酒酵母和乳酸菌對(duì)棕櫚果渣和空果串的發(fā)酵。故粉碎長(zhǎng)度選擇5cm為宜。

2.2.1.2 配料比的影響

在粉碎長(zhǎng)度5cm，含水量30%，發(fā)酵時(shí)間30d，配料比分別為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12條件下，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析配料比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)配料比在1∶8～1∶10時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值隨配料比的增大而呈顯著增加趨勢(shì)(P＜0.05)，繼續(xù)增大配料比，營(yíng)養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這說(shuō)明配料比過(guò)小，會(huì)致使菌落數(shù)劇增過(guò)快，從而產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，導(dǎo)致菌種容易衰老，不利于發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的提高，配料比過(guò)大，總菌落增長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵成本的提升，同時(shí)會(huì)降低菌種活力，從而使菌種降解底物能力下降，營(yíng)養(yǎng)成分含量降低。配料比為1∶10時(shí)，既能保證合理縮短發(fā)酵周期，又能得到較高的營(yíng)養(yǎng)成分含量。故配料比選擇1∶10為宜。

2.2.1.3 含水量的影響

在粉碎長(zhǎng)度5cm，配料比1∶10，發(fā)酵時(shí)間30d，含水量分別為25%、30%、35%、40%、45%條件下，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，當(dāng)含水量在25%～35%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值隨含水量的增大呈顯著增加趨勢(shì)(P＜0.05)，繼續(xù)加大含水量，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于含水量過(guò)低，導(dǎo)致固態(tài)介質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)成分溶解度的下降及較低的基質(zhì)膨潤(rùn)度，微生物生長(zhǎng)受抑制，營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)換率降低，而含水量過(guò)高，導(dǎo)致基質(zhì)顆粒間孔隙率的降低、黏性增加，增加了微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2的傳質(zhì)阻力，抑制微生物生長(zhǎng)發(fā)酵。故含水量選擇35%為宜。

2.2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

在粉碎長(zhǎng)度5cm，配料比1∶10，含水量35%，發(fā)酵時(shí)間分別為25、30、35、40、45d條件下，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在25～35d時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上升(P＜0.05)，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值呈平緩上升趨勢(shì)(P＞0.05)，這是由于發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分濃度始終在變化，一般高峰生長(zhǎng)階段時(shí)間越長(zhǎng)，其生產(chǎn)率越高，但到一定時(shí)間后生產(chǎn)率提高緩慢。為了獲得更多的產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分，時(shí)間過(guò)短，不足以獲得所需的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)品;時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于環(huán)境已不利于菌體生長(zhǎng)，往往會(huì)造成菌體消溶，同時(shí)增加生產(chǎn)成本。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇35d為宜。

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)原理，以粉碎長(zhǎng)度(X1)、配料比(X2)、含水量(X3)和發(fā)酵時(shí)間(X4)為響應(yīng)變量，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平見表5，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

利用DesignExpert10.0.4軟件對(duì)表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到粉碎長(zhǎng)度、配料比、含水量和發(fā)酵時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸方程:OD值=0.95-0.025X1+0.17X2+0.026X3+0.049X4+0.001X1X2+0.026X1X3+0.024X1X4-0.021X2X3+0.002X2X4-0.005X3X4-0.019X21-0.53X22-0.088X23-0.18X24。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表7。

由表7可知，二次回歸模型F值為162.210，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.2341＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9939，說(shuō)明99.39%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實(shí)際情況擬合，較好地反映了發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值與粉碎長(zhǎng)度、配料比、含水量、發(fā)132CHINAOILSANDFATS2020Vol.45No.3酵時(shí)間之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9877，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有98.77%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)表7中F值可判斷各自變量對(duì)因變量的影響依次為X2＞X4＞X3＞X1，即配料比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵時(shí)間(P＜0.01)、含水量(P＜0.05)和粉碎長(zhǎng)度(P＜0.05)。由回歸方程和方差分析可知，二次項(xiàng)中X22、X23、X24對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。

2.2.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物制備的最佳工藝條件為粉碎長(zhǎng)度3.94cm、配料比1∶10.16、含水量35.23%、發(fā)酵時(shí)間35.50d，此條件下OD值為0.976。

2.2.2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時(shí)為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，將發(fā)酵產(chǎn)物制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為粉碎長(zhǎng)度4cm、配料比1∶10、含水量35%、發(fā)酵時(shí)間36d，該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，OD值為0.966，RSD為1.66%，與模型預(yù)測(cè)值誤差為1.02%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)OD值與預(yù)測(cè)OD值差異不顯著(P=0.376＞0.05)。說(shuō)明該模型可以有效預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用于指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對(duì)棕櫚粕渣飼料的發(fā)酵工藝。

2.3 成分分析

優(yōu)化條件下對(duì)基料和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行主要成分分析，結(jié)果見表8。

由表8可知:棕櫚仁渣經(jīng)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，總菌落數(shù)為7.2×1010個(gè)/g;發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，總菌落數(shù)為9.0×107個(gè)/g。

通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物替代部分傳統(tǒng)粗飼料中玉米秸稈后進(jìn)行肉牛喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，肉牛健康狀況良好，飼料消化吸收利用率高，育肥效果顯著。因此，該研究可為啤酒酵母和乳酸菌應(yīng)用于棕櫚粕渣發(fā)酵飼料工業(yè)及棕櫚粕渣資源高值化利用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

3結(jié)論

本文采用啤酒酵母和乳酸菌對(duì)棕櫚粕渣飼料基料(棕櫚仁渣)的發(fā)酵條件和以制備的基料、棕櫚果渣、棕櫚空果串為原料進(jìn)行二次發(fā)酵的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件，運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，分別建立了基料中總菌落數(shù)和發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值與發(fā)酵條件各因素間的擬合模型，對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間5d，棕櫚仁渣目數(shù)70目，菌料比1∶103，發(fā)酵溫度30℃，含水量36%;發(fā)酵產(chǎn)物的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度30℃，棕櫚果渣與空果串配比1∶2，棕櫚果渣及空果串粉碎長(zhǎng)度4cm，配料比1∶10，含水量35%，發(fā)酵時(shí)間36d。在最佳工藝條件下，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基料和發(fā)酵產(chǎn)物主要成分進(jìn)行分析，基料的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，總菌落數(shù)為7.2×1010個(gè)/g;發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分OD值為0.966，總菌落數(shù)為9.0×107個(gè)/g。驗(yàn)證及分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，該優(yōu)化工藝方法合理可行。通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物替代部分傳統(tǒng)粗飼料中玉米秸稈后進(jìn)行肉牛喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，肉牛健康狀況良好，飼料消化吸收利用率高，育肥效果顯著。

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